熒光定量PCR儀選擇要規避的問題
2012-06-19
熒光定量PCR選擇的兩個誤區：
誤區一：儀器通道越多越好
隨著PCR技術的成熟運用，多重擴增越來越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。從最初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發展到如今各個廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無所適從，就有人一不小心走進了“通道越多越好”的誤區。
在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時，為了確保實驗結果的精確性和準確性都要在實驗中使用ROX(一種)或專用的Reference dye ，這些熒光染料都必須單獨使用一個檢測通道。這樣以來，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個，而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠家的專用的熒光染料或試劑開放的，有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購買前確認熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要，不能單單只聽宣傳。考慮多重熒光定量PCR的通道數的時候也應該從實驗室實際情況出發，多重PCR并非人人適用、人人可用，因為它使實驗復雜化了。
誤區二：real-time PCR儀無需梯度功能
對于使用染料法的定量PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算熔解溫度(Tm值)，但運用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬化，對于特殊片斷，經驗公式得到的數據不一定能得出準確的結果，退火溫度細微的差異對結果都可能產生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現部分解決了一些問題——在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在指定范圍內按照梯度變化，根據結果，一步就可以摸索出最適合的反應條件。
不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數高保真Taq酶來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的最佳反應溫度可能有顯著差異，優化延伸溫度就顯得很重要。
使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優化過程，簡化了摸索 PCR反應條件的繁瑣實驗，既節省實驗時間提高效率，又節省實驗成本。
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